【研究意义】红麻(HibiscuscannabinusL.)是锦葵科(Malvaceae)木槿属(Hibiscus)一年生韧皮纤维作物，其茎秆和韧皮纤维已广泛应用于造纸、纺织、汽车制造及家具等领域，是我国重要的经济作物[1-2]。红麻具有耐旱、易栽培等特点，适宜种植区域广，且具有极大的生物产量和较强的二氧化碳吸收能力。因此，红麻被认为是21世纪最具潜力的经济作物[3]。红麻以收获茎秆或韧皮纤维为主要栽培目的，其杂种优势十分明显。2002年，周瑞阳教授在海南冬繁的红麻野生型UG93后代中发现一株雄性不育突变体，当即以栽培种为父本与之杂交(测交)，发现部分F1代表现完全雄性不育，证实该突变株属于细胞质雄性不育(CMS)类型[4]，此后于2003年选育出高抗红麻炭疽病的CMS系K03A及其相应的保持系K03B，并实现红麻三系配套[5]，于2008年选育出世界上第一个由CMS系配制的红麻杂交种红优1号[6]。已有研究表明，植物CMS与线粒体基因atp6密切相关，红麻三系杂交种虽已成为国家麻类产业技术体系的主推品种，但迄今关于红麻CMS的分子机理仍未阐明。因此，构建红麻线粒体基因atp6过表达载体遗传转化体系，对红麻线粒体基因的遗传转化及功能研究具有重要意义。【前人研究进展】最早发现atp6基因对植物CMS具有调控作用的是在玉米CMS-T的rrn26基因和atp6基因部分序列共转录时，编码一个与线粒体内膜密切相关的毒性蛋白，导致玉米CMS[7-8]。随后发现油菜Pol型CMS系中atp6/orf224共转录引起油菜CMS-Pol型CMS[9-10]。同时，水稻CMS-BT的orf79基因和CMS-HL的orfH79基因与线粒体atp6基因共转录，编码一个N端与COX1相似的毒性膜蛋白，导致水稻CMS-HL型和CMS-BT型CMS[11]。此外，有研究发现芥菜atp6/orf228共转录产物编码的毒性蛋白与atp6/orf263基因编码的膜蛋白分别导致芥菜CMS-Hau型和CMS-Tour型CMS[12-13]，甜菜preSatp6基因编码产生35 kD膜蛋白引起甜菜CMS-Owen型CMS[14]。李刚[15]采用iTRAQ(同重标签相对与绝对定量)标记红麻CMS系L23A和保持系L23B花药线粒体蛋白，发现ATP6在不育系中的表达量显著低于保持系，推测ATP6对红麻花药发育发挥重要作用。在同质异核不育系P3A中，atp6基因的编码区(CDS)序列与保持系P3B相比缺失30 bp，基于CDS序列差异特征对红麻现有的CMS系、保持系、F1和F2代及104份种植资源进行检测，证实不育系中30 bp的缺失与红麻细胞质雄性不育密切相关[16]。廖小芳[17]用Northern blotling对红麻质核同源的UG93A和UG93B的atp6基因进行转录本分析，发现不育系比保持系多一个大小为2.0 kb的转录本，且atp6基因在不育系中的表达量显著低于保持系，推测atp6基因可能与红麻CMS密切相关。【本研究切入点】目前，关于红麻atp6基因过表达载体遗传转化体系构建的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】以红麻UG93A花药cDNA为模板，通过同源克隆技术克隆atp6基因的CDS全长序列；利用In-Fusion基因融合技术构建pBI121-atp6-EGFP植物过表达载体，通过农杆菌介导法转化野生型烟草，经抗性筛选和目的基因PCR验证转基因烟草，为红麻线粒体基因的遗传转化和功能研究打下基础。 1材料与方法 1.1试验材料 试验于2017年5月至2018年4月在广西大学农学院综合楼植物遗传育种实验室进行。红麻不育系UG93A、植物表达载体pBI121及野生型烟草种子为本课题组保存提供；根癌农杆菌EHA105感受态细胞、大肠杆菌感受态DH5α细胞和高保真酶购自北京全式金生物技术有限公司；红麻花药总RNA提取试剂盒购自北京华越洋公司，限制性内切酶KPnI、XbaI和M×Buffer购自TaKaRa公司。PCR产物回收试剂盒、质粒提取试剂盒和标准DNA-Marker购自南京诺唯赞生物科技有限公司和北京艾德莱生物科技有限公司，引物合成由深圳华大基因科技有限公司完成，菌液测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。 1.2试验方法 1.2.1 引物合成 通过Premier 5.0设计atp6、EGFP及pBI121载体上游引物序列，具体序列信息如表1。 1.2.2atp6基因过表达载体构建与转化 (1)过表达基因片段克隆。根据试剂盒说明提取红麻UG93A的总RNA(北京华越洋生物科技有限公司)，参照全式金反转录试剂盒说明将UG93A总RNA反转录合成cDNA；以此为模板，用引物组合eF-atp6-F/eF-atp6-R扩增atp6基因CDS全长序列。 表1 本研究所用引物序列Table 1 Primers sequences used in this study引物名称Primer name引物序列(5’-3’)Primer sequence(5’-3’)eF-atp6F:GAGAACACGGGGGACTCTAGAATGAAAAGGACTATGTTTGTAAATATCATGeF-atp6R:GCCCTTGCTCACCATGGTACCATGAAGATTTATAGCATCATTTAAGTAAATACAGEGFP-R:CGATGGGGGTGTTCTGCTGGTApBI121-Z-F:GGAGAGAACACGGGGGACTCTAGA PCR反应体系50.0 μl：cDNA 2.5 μl，10×PCR Buffer 25.0 μl，Primer F(eF-atp6F) 1.5 μl，Primer R(eF-atp6R) 1.5 μl，ddH2O补足50.0 μl。扩增程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，56.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸80 s，进行30个循环；72 ℃复性10 min，4 ℃保存；最后用1.0 %琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，用DNA胶回收试剂盒回收目的片段，-20 ℃保存备用。 (2)目的载体构建。提取本课题组构建的pBI121-FullHcpdil5-2a-EGFP载体质粒，用限制性内切酶XbaI和KpnI对该载体进行双酶切。酶切体系50.0 μl：10×Buffer 5.0 μl，XbaI 2.5 μl，KpnI 2.5 μl，质粒DNA 1.0 μg，ddH2O补足50.0 μl。切下FullHcpdil5-2a基因后得到线性载体pBI121，用DNA胶回收试剂盒回收切下的线性载体pBI121。将回收到的atp6基因全长片段与上述线性载体pBI121进行同源重组反应，其反应体系为：线性载体(pBI121)4.0 μl，插入片段(atp6基因)0.7 μl，5×CE Multis Buffer 4.0 μl，Exnase Multis 2.0 μl，ddH2O 9.3 μl。用移液枪上下轻微吹打几次混匀，37 ℃反应30 min，反应结束立即置于冰浴中冷却5 min直接进行大肠杆菌转化。 (3)目的条带检测与测序。在无菌超净工作台上，随机挑取白色菌落8个，置于盛有1 mL LB液体培养基(加入终浓度0.1 mg/mL的Kan)的2 mL离心管中；37 ℃下200 r/min振荡培养12 h；按照目的基因扩增反应体系及程序进行菌液PCR检测；1.0 %琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，有目的条带则为阳性菌落；在超净工作台上，将每个阳性克隆菌液分为2份，每份加入150.0 μl 60 %甘油，混匀，其中一份随机选取4个阳性克隆并编号，送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，另一部分菌液-80 ℃保存备用。利用DNAMAN 8对测序结果进行分析。选择正确的克隆进行质粒提取，并转化农杆菌EHA105感受态细胞，为农杆菌侵染烟草叶盘法作准备。 (4)过表达载体质粒双酶切验证。选定上述测序成功的一个菌样，于超净工作台上吸取200.0 μl置于盛有100 mL LB液体培养基(加入终浓度0.1 mg/mL的Kan)的200 mL锥形瓶中。37 ℃下200 r/min振荡培养12 h；根据试剂盒说明提取质粒，进行双酶切，置于PCR仪中进行37 ℃酶切反应3 h，最后用1.0 %琼脂糖凝胶电泳检测双酶切PCR产物，对过表达载体构建进行验证。 (5)过表达载体转化烟草。选取比较健壮的烟草非转基因无菌苗，摘取叶片，用无菌打孔器分成小块，转移至烟草叶片预培养基中25 ℃暗培养3 d。将制备好的农杆菌工程菌液侵染烟草叶片。将预培养后的烟草叶片转移至200 mL玻璃瓶中，用农杆菌工程菌液悬浮侵染10 min；弃菌液，将烟草叶片转移至滤纸上吸干叶片表面水分；最后，将烟草叶片转移至共培养基上(培养基上铺一层无菌滤纸)，25 ℃ 暗培养3 d。将共培养后的烟草叶片取出转移至培养瓶中，用无菌水漂洗(漂洗4～5次，每次15 min)，再用含有500 mg/L头孢霉素的无菌水漂洗(漂洗3次，每次10 min)；倒去漂洗液，将烟草叶片置于无菌吸水纸上，沥干烟草叶片表面水分；将烟草叶片接种于芽诱导培养基上，在光照强度2000 lx、光照16 h/黑暗8 h交替的条件下26 ℃培养；每隔12 d，将烟草叶片愈伤组织继代1次，直至长出不定芽。当转基因烟草不定芽长2～3 cm时，切下不定芽，转移至生根培养基中诱导不定芽生根，待转基因幼苗的不定根长5～6 cm时，练苗移栽，进行阳性转基因烟草检测。 2结果与分析 2.1目的基因的克隆结果 从图1可看出，以红麻不育系UG93A的cDNA为模板克隆atp6基因的CDS全长，扩增产物大小为1182 bp。从图2可看出，不育系UG93A的atp6基因CDS序列与保持系UG93B相比，atp6基因的CDS中有24 bp缺失和3 bp插入，而与红麻同质异核的CMS系P3A相比，不育系UG93A在atp6基因起始密码子的下游第59 bp处缺失6个碱基(GTTTTT)，推测该位点可能是红麻线粒体基因重组的活跃位点，即atp6基因与红麻CMS密切相关。 2.2过表达载体的构建结果 对保存的pBI121-FullHcpdil5-2a-EGFP载体进行双酶切，切下片段长度为1314 bp的FullHcpdil5-2a基因，回收长度约为14 829 bp的线性载体pBI121(图3)。将回收的线性pBI121与atp6基因连接获得重组载体pBI121-atp6-EGFP，将重组载体连接、转化、菌液PCR检测阳性克隆(图4)。将阳性菌液送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，提取阳性质粒进行双酶切鉴定，以过表达载体基因pBI121-atp6-EGFP载体质粒作为阳性对照，结果显示双酶切切下的目的片段与连接的目的片段(atp6基因)大小一致(图5)，说明过表达载体构建正确，可用于后续的农杆菌转化。 M：DNA分子质量标准(DL 2000)；1：atp6基因M：DNA marker(DL 2000)；1：atp6gene图1 目的基因的PCR扩增电泳结果Fig.1 PCR amplification electrophoresis of the target gene 图2 红麻UG93A和UG93B的atp6基因序列比对Fig.2 Similarity matching ofatp6gene sequence between UG93A and UG93B in Kenaf M：DNA分子质量标准(AL 15 000)；1：pBI121-FullHcpdil5-2a-EGFP载体基因；2：线性载体片段pBI121(13 233 bp)及Hcpdil5-2a基因(1314 bp)M：DNA marker(AL 15 000)；1：Gene of pBI121-FullHcpdil5-2a-EGFP vector；2：The linearized pBI121 vector fragment(13 233 bp) and gene ofHcpdil5-2a(1314 bp)图3 pBI121-FullHcpdil5-2a-EGFP载体的双酶切鉴定结果Fig.3 Restriction enzyme digestion of pBI121-FullHcpdil5-2a-EGFP vector 2.3农杆菌介导的侵染叶盘法转化烟草 2.3.1 叶盘法转化烟草 将过表达载体pBI121-atp6-EGFP转化农杆菌，以保存的烟草K346为转基因受体，采用农杆菌侵染叶盘法进行转化，以未侵染农杆菌的野生型烟草为阴性对照，烟草叶盘的芽诱导和根诱导培养阶段如图6所示。其中，图6-A为芽诱导时期的野生型烟草叶盘(阴性对照)，出芽较快且芽点较多；图6-B的叶盘经过pBI121-atp6-EGFP农杆菌侵染处理，放于含有抗生素的培养基中进行抗性芽筛选培养，出芽慢且芽点明显变少。说明芽诱导阶段转基因烟草抗性芽获得率较低。图6-C(阴性对照)和图6-D为烟草的根诱导培养阶段，与野生型对照(图6-C)相比，转基因植株(图6-D)生长缓慢，根生长也较慢且较少。 2.3.2 转基因烟草阳性植株的鉴定 将筛选所得 M：DNA分子质量标准(DL2000)；2～14：正确连接载体基因pBI121-atp6-EGFPM：DNA marker(DL2000)；2-14：Correct connecting vector genes pBI121-atp6-EGFP图4 pBI121-atp6-EGFP载体的PCR验证结果Fig.4 PCR varification of pBI121-atp6-EGFP vector 到的抗性植株(pBI121-atp6-EGFP：简称B)分别用3对不同的引物组合(ef-atp6-F/EGFP-R、ef-atp6-F/ef-atp6-R和pBI121-Z-F/ef-atp6-R)进行PCR检测，筛选阳性植株。其中，引物组合ef-atp6-F/EGFP-R是以目的基因atp6的上游序列为正向引物，以表达载体pBI121多克隆位点的EGFP为反向引物，扩增出目的片段约1681 bp；引物组合ef-atp6-F/ef-atp6-R是以atp6基因CDS序列为特异引物，扩增出目的片段约1182 bp；引物组合pBI121-Z-F/ef-atp6-R是以pBI121载体序列为正向引物，以atp6基因下游序列为反向引物，扩增出目的片段约1206 bp。从图7可看出，以野生型植株和ddH2O为阴性对照、过表达载体质粒为阳性对照，用3对不同的引物组合对经Kan抗性筛选的4株转基因植株(B1、B2、B3和B4)进行PCR扩增，共获得2株含pBI121-atp6-EGFP(B)的T0代转基因阳性植株B1和B2。 3讨 论 3.1atp6基因与植物CMS的关系 M：DNA分子质量标准(AL 15000)；1：载体基因质粒pBI121-atp6-EGFP双酶切片段atp6(1182 bp)；2：对照：载体质粒pBI121-atp6-EGFPM：DNA marker(AL 15000)；1：Restriction fragment ofatp6(1182 bp) from vector gene plasmid pBI121-atp6-EGFP；2：Control: pBI121-atp6-EGFP vector plasmid图5 pBI121-atp6-EGFP过表达载体的双酶切鉴定结果Fig.5 Identified by restriction enzyme digestion of pBI121-atp6-EGFP overexpression vector A和B为烟草叶盘芽诱导培养，其中A为野生型烟草芽，B为转基因烟草抗性芽；C和D为烟草根诱导培养，其中C为野生型烟草根诱导生长，D为转基因烟草植株根诱导生长Induction culture of leaf disc bud of tobacco with A and B，A was wild type tobacco bud，B was transgenic resistant bud；Root induction culture of tobacco with C and D，C was root induction of wild type tobacco，D was root induction of transgenic plants图6 叶盘法转化烟草的诱导培养Fig.6 Induced culture of tobacco by leaf disc method M1：DNA分子质量标准(AL 15000)；1：质粒pBI 121-atp6-EGFP(1681 bp)；2：WT；3：H2O；4～7(B1-B4)：烟草鉴定材料，其中4和5(B1和B2)为pBI121-atp6-EGFP转基因材料(1681 bp)；M2：DNA分子质量标准(DL2000)；8：质粒pBI121-atp6-EGFP(1182 bp)；9：WT；10：H2O；11～14(B1-B4)：烟草鉴定材料，其中11和12(B1和B2)为pBI121-atp6-EGFP转基因材料(1182 bp)；15：质粒pBI121-atp6-EGFP(1206 bp)；16：WT；17：H2O；18～21(B1-B4)：烟草鉴定材料，其中18和19(B1和B2)为pBI121-atp6-EGFP转基因材料(1206 bp)M1：DNA marker(AL 15000)；1：pBI 121-atp6-EGFP(1681 bp)；2：WT；3：H2O；4-7(B1-B4)：Identification of transgenic plant，4 and 5(B1 and B2)：transgenic plants of pBI121-atp6-EGFP(1681 bp)；M2：DNA marker(DL2000)；8：pBI121-atp6-EGFP(1182 bp)；9：WT；10：H2O；11-14(B1-B4)：Identification of transgenic plant，11 and 12(B1 and B2)：Transgenic plants of pBI121-atp6-EGFP(1182 bp)；15：pBI121-atp6-EGFP(1206 bp)；16：WT；17：H2O；18-21(B1-B4)：Identification of transgenic plant，18 and 19(B1 and B2)：Transgenic plants of pBI121-atp6-EGFP(1206 bp)图7 转基因烟草阳性植株的鉴定结果Fig.7 PCR identification of transgenic positive plants 已有研究表明植物雄性不育与线粒体DNA的变异紧密相关[18-19]。基因重组产生嵌合基因或新的阅读框，出现新的蛋白基因表达产物或引起正常线粒体基因转录、RNA编辑和蛋白翻译异常，造成线粒体能量代谢或ATP复合体蛋白亚基异常，使线粒体发生功能紊乱，从而产生CMS[20]。atp6是植物线粒体呼吸链复合体V的亚基，作为呼吸链上重要组成部分，呼吸异常导致能量供应不足，而在小孢子发育过程中需要大量能量，能量供应不足导致花粉败育[21]。在玉米[8]、油菜[9]、水稻[11]、芥菜[12]和苎麻[22]等植物中均发现atp6基因导致植物CMS。前期对红麻花粉发育过程的研究表明，atp6在红麻花粉发育过程中发挥非常关键的作用[15]，暗示atp6CMS与红麻CMS密切相关。本研究发现，与红麻保持系UG93B序列比对，UG93A 的atp6基因CDS有24 bp缺失和3 bp插入，与红麻的CMS P3A相比，UG93A在atp6基因起始密码子的下游第59 bp处少6个碱基(GTTTTT)，推测该位点可能是红麻线粒体基因重组的活跃位点，进一步表明atp6基因与红麻CMS密切相关。关于atp6基因与红麻CMS的更深层次关系本课题组正在探究。 3.2过表达载体的构建为红麻基因功能研究打下基础 目前，红麻CMS的分子机理研究虽取得较大进展，但关于红麻CMS核质作用的分子机制仍未清楚，对红麻CMS相关atp6基因的研究不够透彻[23]。为了进一步验证和分析红麻UG93S的CMS相关基因atp6功能，本研究以红麻不育材料UG93A的cDNA为模板利用同源克隆技术克隆atp6基因序列，通过In-Fusion融合技术研究方法成功构建pBI121-atp6-EGFP植物过表达载体，并以农杆菌介导法转化烟草，获得2株转基因阳性烟草植株；利用3对引物组合对转基因阳性植株进行鉴定，其中两对引物是利用pBI121表达载体序列与目的基因序列组合的方式进行鉴定，可有效避免单一使用目的基因鉴定转基因植株易造成的假阳性现象，且操作省时简便。构建过表达载体是研究红麻atp6基因的关键步骤[24]，转基因烟草的成功获得为后续从分子蛋白表达、细胞定位及生物学形态等层面开展atp6基因与红麻CMS功能验证研究提供材料基础[25-26]。 4结 论 从红麻不育系UG93A中获得atp6基因CDS全长1182 bp，并以UG93A中atp6基因cDNA为模板成功构建pBI 121-atp6-EGFP过表达载体，转化野生型烟草后获得2株转基因阳性烟草植株。构建的红麻线粒体基因atp6过表达载体遗传转化体系，可用于指导后续atp6基因调控红麻CMS分子机理研究。 [1]史春霞，白 洋，郁崇文. 黄、红麻资源的优化与开发利用[J]. 中国麻作，2001，23(1)：41-44. [2]陶爱芬，张晓琛，祁建民. 红麻综合利用研究进展与产业化前景[J]. 中国麻业科学，2007，29(1)：1-5. [3]李德芳. 红/黄麻新用途综合开发与国际合作[J]. 中国麻业科学，2007，29(S2)：411-414. [4]周瑞阳. 红麻雄性不育株的发现[J]. 中国农业科学，2002，35(2)：213-213. [5]周瑞阳，张 新，张加强，等. 红麻细胞质雄性不育系的选育及杂种优势利用取得突破[J]. 中国农业科学，2008(1)：314. [6]刘恒蔚，周瑞阳，徐 俐. 光敏感雌性不育苎麻的光周期反应特性研究[J]. 作物学报，2003，29(2)：222-224. [7]Dewey R E，Timothy D H，Levings C R. Chimeric mitochondrial genes expressed in the male-sterile cytoplasm of maize[J]. Current Genetics，1992，20(6)：475-482. [8]Dewey R E，Timothy D H，Levings C S. A mitochondrial protein associated with cytoplasmic male sterility in the Tcytoplasm of maize[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1987，84：155374-155378. [9]Handa H，Gualberto J M，Grienenberger J M. Characterization of the mitochondrialorfBgene and its derivative，orf224，a chimeric open reading frame specific to one mitochondriagenome of the ‘Polima’ male-sterile cytoplasm in rapeseed(BrassicanapusL.)[J]. Current Genetics，1995，28(6)：546-552. [10]Wang H M，Ketela T，Keller W A，et al. Genetic correlation of theorf224/atp6gene region with Polima CMS inBrassicasomatichybrids[J]. Plant Molecular Biology,1995，27(4)：801-807. [11]Wang K，Gao F，Ji Y，et al. ORFH79 impair mitochondrial function via interaction with a subunit of electron transport chain complex III in Honglian cytoplasmic male sterile rice[J]. New Phytologist,2013，198(2)：408-418. [12]Jing B，Heng S，Tong D，et al. Malsterility-associated cytotoxic protein ORF288 inBrassicajunceacauses aborted pollen development[J]. Journal of Experimental Botany，2012，63(3)：1285-1295. [13]Landgren M，Zetterstrand M，Sundberg E，et al. Alloplasmic male-sterileBrassicalines containingB.tournefortiimitochondria express an ORF 3'' of theatp6gene and a 32 kDa protein[J]. Plant Molecular Biology,1996，32(5)：879-890. [14]Matsuhira H，Kagami H，Kurata M，et al. Unusual and typicafeatures of a novel restorer-of-fertility gene of sugar beet (BetavulgarisL.)[J]. Genetics，2012，192(4)：1347-1358. [15]李 刚. 红麻细胞质雄性不育系线粒体蛋白质组差异分析与不育相关基因的发掘[D]. 南京：广西大学，2009. [16] Zhao Y，Liao X，Zhou B，et al. Mutation in the coding sequence ofatp6are associated with male sterile cytoplasm in kenaf(HibiscuscannabinusL)[J]. Euphytica，2016，207：169-175. [17]廖小芳. 红麻UG93A和UG93B线粒体基因组差异分析及CMS相关基因的发掘[D]. 南宁：广西大学，2015. [18]凌杏元. 植物胞质雄性不育分子机理研究进展团[J]. 植物学通报，2000，17(4)：319-332. [19]王永飞，马三梅，张鲁刚，等. 植物细胞质雄性不育的分子机理研究进展[J]. 自然科学进展，2002，12(10)：1009-1014. [20]梅启明. 红莲型和野败型水稻胞质雄性不育系mtDNA的比较研究明[J]. 武汉植物科学，1990，8(1)：2529. [21]史公军. 不结球白菜胞质雄性不育系atp6基因cDNA片段的克隆及序列分析[A]. 中国园艺学会蔬菜专业委员会、中国农业科学院蔬菜花卉研究所. 蔬菜分子育种研讨会论文集[C]. 北京：中国园艺学会，2004. [22]段继强，杜光辉，李建永，等. 苎麻atp6和atp9基因的克隆表达及与细胞质雄性不育的相关性[J]. 遗传，2008，30(11)：1487-1498. [23]赵艳红. 红麻atp9、atp6、atpA基因克隆、功能分析与分子标签发掘[D]. 广西大学，2014. [24]Zhu Y,Wang Z，Jing Y J，et al. Ectopic over-expression of BhHsfl，a heat shock factor from the resurrection plant Boea grometrica，leads to increased thermotolerance and retarded growth in transgenic Arabidopsis and tobacco[J]. Plant Molecular Biology,2009，71：451-467. [25]丁林云，张 微，王晋成，等. 过量表达棉花GhSAP1提高转基因烟草的耐盐性[J]. 中国农业科学，2014，47(8)：1458-1470. [26]魏东阳. 蛋白质组学及其应用研究[J]. 现代商贸工业，2019，40(16)：79-81. 【研究意义】红麻(HibiscuscannabinusL.)是锦葵科(Malvaceae)木槿属(Hibiscus)一年生韧皮纤维作物，其茎秆和韧皮纤维已广泛应用于造纸、纺织、汽车制造及家具等领域，是我国重要的经济作物[1-2]。红麻具有耐旱、易栽培等特点，适宜种植区域广，且具有极大的生物产量和较强的二氧化碳吸收能力。因此，红麻被认为是21世纪最具潜力的经济作物[3]。红麻以收获茎秆或韧皮纤维为主要栽培目的，其杂种优势十分明显。2002年，周瑞阳教授在海南冬繁的红麻野生型UG93后代中发现一株雄性不育突变体，当即以栽培种为父本与之杂交(测交)，发现部分F1代表现完全雄性不育，证实该突变株属于细胞质雄性不育(CMS)类型[4]，此后于2003年选育出高抗红麻炭疽病的CMS系K03A及其相应的保持系K03B，并实现红麻三系配套[5]，于2008年选育出世界上第一个由CMS系配制的红麻杂交种红优1号[6]。已有研究表明，植物CMS与线粒体基因atp6密切相关，红麻三系杂交种虽已成为国家麻类产业技术体系的主推品种，但迄今关于红麻CMS的分子机理仍未阐明。因此，构建红麻线粒体基因atp6过表达载体遗传转化体系，对红麻线粒体基因的遗传转化及功能研究具有重要意义。【前人研究进展】最早发现atp6基因对植物CMS具有调控作用的是在玉米CMS-T的rrn26基因和atp6基因部分序列共转录时，编码一个与线粒体内膜密切相关的毒性蛋白，导致玉米CMS[7-8]。随后发现油菜Pol型CMS系中atp6/orf224共转录引起油菜CMS-Pol型CMS[9-10]。同时，水稻CMS-BT的orf79基因和CMS-HL的orfH79基因与线粒体atp6基因共转录，编码一个N端与COX1相似的毒性膜蛋白，导致水稻CMS-HL型和CMS-BT型CMS[11]。此外，有研究发现芥菜atp6/orf228共转录产物编码的毒性蛋白与atp6/orf263基因编码的膜蛋白分别导致芥菜CMS-Hau型和CMS-Tour型CMS[12-13]，甜菜preSatp6基因编码产生35 kD膜蛋白引起甜菜CMS-Owen型CMS[14]。李刚[15]采用iTRAQ(同重标签相对与绝对定量)标记红麻CMS系L23A和保持系L23B花药线粒体蛋白，发现ATP6在不育系中的表达量显著低于保持系，推测ATP6对红麻花药发育发挥重要作用。在同质异核不育系P3A中，atp6基因的编码区(CDS)序列与保持系P3B相比缺失30 bp，基于CDS序列差异特征对红麻现有的CMS系、保持系、F1和F2代及104份种植资源进行检测，证实不育系中30 bp的缺失与红麻细胞质雄性不育密切相关[16]。廖小芳[17]用Northern blotling对红麻质核同源的UG93A和UG93B的atp6基因进行转录本分析，发现不育系比保持系多一个大小为2.0 kb的转录本，且atp6基因在不育系中的表达量显著低于保持系，推测atp6基因可能与红麻CMS密切相关。【本研究切入点】目前，关于红麻atp6基因过表达载体遗传转化体系构建的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】以红麻UG93A花药cDNA为模板，通过同源克隆技术克隆atp6基因的CDS全长序列；利用In-Fusion基因融合技术构建pBI121-atp6-EGFP植物过表达载体，通过农杆菌介导法转化野生型烟草，经抗性筛选和目的基因PCR验证转基因烟草，为红麻线粒体基因的遗传转化和功能研究打下基础。1材料与方法1.1试验材料试验于2017年5月至2018年4月在广西大学农学院综合楼植物遗传育种实验室进行。红麻不育系UG93A、植物表达载体pBI121及野生型烟草种子为本课题组保存提供；根癌农杆菌EHA105感受态细胞、大肠杆菌感受态DH5α细胞和高保真酶购自北京全式金生物技术有限公司；红麻花药总RNA提取试剂盒购自北京华越洋公司，限制性内切酶KPnI、XbaI和M×Buffer购自TaKaRa公司。PCR产物回收试剂盒、质粒提取试剂盒和标准DNA-Marker购自南京诺唯赞生物科技有限公司和北京艾德莱生物科技有限公司，引物合成由深圳华大基因科技有限公司完成，菌液测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。1.2试验方法1.2.1 引物合成 通过Premier 5.0设计atp6、EGFP及pBI121载体上游引物序列，具体序列信息如表1。1.2.2atp6基因过表达载体构建与转化 (1)过表达基因片段克隆。根据试剂盒说明提取红麻UG93A的总RNA(北京华越洋生物科技有限公司)，参照全式金反转录试剂盒说明将UG93A总RNA反转录合成cDNA；以此为模板，用引物组合eF-atp6-F/eF-atp6-R扩增atp6基因CDS全长序列。表1 本研究所用引物序列Table 1 Primers sequences used in this study引物名称Primer name引物序列(5’-3’)Primer sequence(5’-3’)eF-atp6F:GAGAACACGGGGGACTCTAGAATGAAAAGGACTATGTTTGTAAATATCATGeF-atp6R:GCCCTTGCTCACCATGGTACCATGAAGATTTATAGCATCATTTAAGTAAATACAGEGFP-R:CGATGGGGGTGTTCTGCTGGTApBI121-Z-F:GGAGAGAACACGGGGGACTCTAGA注：下划线部分为与pBI121载体同源序列。Note:The sequences with a line are homologous sequences of PBI121 vector.PCR反应体系50.0 μl：cDNA 2.5 μl，10×PCR Buffer 25.0 μl，Primer F(eF-atp6F) 1.5 μl，Primer R(eF-atp6R) 1.5 μl，ddH2O补足50.0 μl。扩增程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，56.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸80 s，进行30个循环；72 ℃复性10 min，4 ℃保存；最后用1.0 %琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，用DNA胶回收试剂盒回收目的片段，-20 ℃保存备用。(2)目的载体构建。提取本课题组构建的pBI121-FullHcpdil5-2a-EGFP载体质粒，用限制性内切酶XbaI和KpnI对该载体进行双酶切。酶切体系50.0 μl：10×Buffer 5.0 μl，XbaI 2.5 μl，KpnI 2.5 μl，质粒DNA 1.0 μg，ddH2O补足50.0 μl。切下FullHcpdil5-2a基因后得到线性载体pBI121，用DNA胶回收试剂盒回收切下的线性载体pBI121。将回收到的atp6基因全长片段与上述线性载体pBI121进行同源重组反应，其反应体系为：线性载体(pBI121)4.0 μl，插入片段(atp6基因)0.7 μl，5×CE Multis Buffer 4.0 μl，Exnase Multis 2.0 μl，ddH2O 9.3 μl。用移液枪上下轻微吹打几次混匀，37 ℃反应30 min，反应结束立即置于冰浴中冷却5 min直接进行大肠杆菌转化。(3)目的条带检测与测序。在无菌超净工作台上，随机挑取白色菌落8个，置于盛有1 mL LB液体培养基(加入终浓度0.1 mg/mL的Kan)的2 mL离心管中；37 ℃下200 r/min振荡培养12 h；按照目的基因扩增反应体系及程序进行菌液PCR检测；1.0 %琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，有目的条带则为阳性菌落；在超净工作台上，将每个阳性克隆菌液分为2份，每份加入150.0 μl 60 %甘油，混匀，其中一份随机选取4个阳性克隆并编号，送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，另一部分菌液-80 ℃保存备用。利用DNAMAN 8对测序结果进行分析。选择正确的克隆进行质粒提取，并转化农杆菌EHA105感受态细胞，为农杆菌侵染烟草叶盘法作准备。(4)过表达载体质粒双酶切验证。选定上述测序成功的一个菌样，于超净工作台上吸取200.0 μl置于盛有100 mL LB液体培养基(加入终浓度0.1 mg/mL的Kan)的200 mL锥形瓶中。37 ℃下200 r/min振荡培养12 h；根据试剂盒说明提取质粒，进行双酶切，置于PCR仪中进行37 ℃酶切反应3 h，最后用1.0 %琼脂糖凝胶电泳检测双酶切PCR产物，对过表达载体构建进行验证。(5)过表达载体转化烟草。选取比较健壮的烟草非转基因无菌苗，摘取叶片，用无菌打孔器分成小块，转移至烟草叶片预培养基中25 ℃暗培养3 d。将制备好的农杆菌工程菌液侵染烟草叶片。将预培养后的烟草叶片转移至200 mL玻璃瓶中，用农杆菌工程菌液悬浮侵染10 min；弃菌液，将烟草叶片转移至滤纸上吸干叶片表面水分；最后，将烟草叶片转移至共培养基上(培养基上铺一层无菌滤纸)，25 ℃ 暗培养3 d。将共培养后的烟草叶片取出转移至培养瓶中，用无菌水漂洗(漂洗4～5次，每次15 min)，再用含有500 mg/L头孢霉素的无菌水漂洗(漂洗3次，每次10 min)；倒去漂洗液，将烟草叶片置于无菌吸水纸上，沥干烟草叶片表面水分；将烟草叶片接种于芽诱导培养基上，在光照强度2000 lx、光照16 h/黑暗8 h交替的条件下26 ℃培养；每隔12 d，将烟草叶片愈伤组织继代1次，直至长出不定芽。当转基因烟草不定芽长2～3 cm时，切下不定芽，转移至生根培养基中诱导不定芽生根，待转基因幼苗的不定根长5～6 cm时，练苗移栽，进行阳性转基因烟草检测。2结果与分析2.1目的基因的克隆结果从图1可看出，以红麻不育系UG93A的cDNA为模板克隆atp6基因的CDS全长，扩增产物大小为1182 bp。从图2可看出，不育系UG93A的atp6基因CDS序列与保持系UG93B相比，atp6基因的CDS中有24 bp缺失和3 bp插入，而与红麻同质异核的CMS系P3A相比，不育系UG93A在atp6基因起始密码子的下游第59 bp处缺失6个碱基(GTTTTT)，推测该位点可能是红麻线粒体基因重组的活跃位点，即atp6基因与红麻CMS密切相关。2.2过表达载体的构建结果对保存的pBI121-FullHcpdil5-2a-EGFP载体进行双酶切，切下片段长度为1314 bp的FullHcpdil5-2a基因，回收长度约为14 829 bp的线性载体pBI121(图3)。将回收的线性pBI121与atp6基因连接获得重组载体pBI121-atp6-EGFP，将重组载体连接、转化、菌液PCR检测阳性克隆(图4)。将阳性菌液送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，提取阳性质粒进行双酶切鉴定，以过表达载体基因pBI121-atp6-EGFP载体质粒作为阳性对照，结果显示双酶切切下的目的片段与连接的目的片段(atp6基因)大小一致(图5)，说明过表达载体构建正确，可用于后续的农杆菌转化。M：DNA分子质量标准(DL 2000)；1：atp6基因M：DNA marker(DL 2000)；1：atp6gene图1 目的基因的PCR扩增电泳结果Fig.1 PCR amplification electrophoresis of the target gene图2 红麻UG93A和UG93B的atp6基因序列比对Fig.2 Similarity matching ofatp6gene sequence between UG93A and UG93B in KenafM：DNA分子质量标准(AL 15 000)；1：pBI121-FullHcpdil5-2a-EGFP载体基因；2：线性载体片段pBI121(13 233 bp)及Hcpdil5-2a基因(1314 bp)M：DNA marker(AL 15 000)；1：Gene of pBI121-FullHcpdil5-2a-EGFP vector；2：The linearized pBI121 vector fragment(13 233 bp) and gene ofHcpdil5-2a(1314 bp)图3 pBI121-FullHcpdil5-2a-EGFP载体的双酶切鉴定结果Fig.3 Restriction enzyme digestion of pBI121-FullHcpdil5-2a-EGFP vector2.3农杆菌介导的侵染叶盘法转化烟草2.3.1 叶盘法转化烟草 将过表达载体pBI121-atp6-EGFP转化农杆菌，以保存的烟草K346为转基因受体，采用农杆菌侵染叶盘法进行转化，以未侵染农杆菌的野生型烟草为阴性对照，烟草叶盘的芽诱导和根诱导培养阶段如图6所示。其中，图6-A为芽诱导时期的野生型烟草叶盘(阴性对照)，出芽较快且芽点较多；图6-B的叶盘经过pBI121-atp6-EGFP农杆菌侵染处理，放于含有抗生素的培养基中进行抗性芽筛选培养，出芽慢且芽点明显变少。说明芽诱导阶段转基因烟草抗性芽获得率较低。图6-C(阴性对照)和图6-D为烟草的根诱导培养阶段，与野生型对照(图6-C)相比，转基因植株(图6-D)生长缓慢，根生长也较慢且较少。2.3.2 转基因烟草阳性植株的鉴定 将筛选所得M：DNA分子质量标准(DL2000)；2～14：正确连接载体基因pBI121-atp6-EGFPM：DNA marker(DL2000)；2-14：Correct connecting vector genes pBI121-atp6-EGFP图4 pBI121-atp6-EGFP载体的PCR验证结果Fig.4 PCR varification of pBI121-atp6-EGFP vector到的抗性植株(pBI121-atp6-EGFP：简称B)分别用3对不同的引物组合(ef-atp6-F/EGFP-R、ef-atp6-F/ef-atp6-R和pBI121-Z-F/ef-atp6-R)进行PCR检测，筛选阳性植株。其中，引物组合ef-atp6-F/EGFP-R是以目的基因atp6的上游序列为正向引物，以表达载体pBI121多克隆位点的EGFP为反向引物，扩增出目的片段约1681 bp；引物组合ef-atp6-F/ef-atp6-R是以atp6基因CDS序列为特异引物，扩增出目的片段约1182 bp；引物组合pBI121-Z-F/ef-atp6-R是以pBI121载体序列为正向引物，以atp6基因下游序列为反向引物，扩增出目的片段约1206 bp。从图7可看出，以野生型植株和ddH2O为阴性对照、过表达载体质粒为阳性对照，用3对不同的引物组合对经Kan抗性筛选的4株转基因植株(B1、B2、B3和B4)进行PCR扩增，共获得2株含pBI121-atp6-EGFP(B)的T0代转基因阳性植株B1和B2。3讨 论3.1atp6基因与植物CMS的关系M：DNA分子质量标准(AL 15000)；1：载体基因质粒pBI121-atp6-EGFP双酶切片段atp6(1182 bp)；2：对照：载体质粒pBI121-atp6-EGFPM：DNA marker(AL 15000)；1：Restriction fragment ofatp6(1182 bp) from vector gene plasmid pBI121-atp6-EGFP；2：Control: pBI121-atp6-EGFP vector plasmid图5 pBI121-atp6-EGFP过表达载体的双酶切鉴定结果Fig.5 Identified by restriction enzyme digestion of pBI121-atp6-EGFP overexpression vectorA和B为烟草叶盘芽诱导培养，其中A为野生型烟草芽，B为转基因烟草抗性芽；C和D为烟草根诱导培养，其中C为野生型烟草根诱导生长，D为转基因烟草植株根诱导生长Induction culture of leaf disc bud of tobacco with A and B，A was wild type tobacco bud，B was transgenic resistant bud；Root induction culture of tobacco with C and D，C was root induction of wild type tobacco，D was root induction of transgenic plants图6 叶盘法转化烟草的诱导培养Fig.6 Induced culture of tobacco by leaf disc methodM1：DNA分子质量标准(AL 15000)；1：质粒pBI 121-atp6-EGFP(1681 bp)；2：WT；3：H2O；4～7(B1-B4)：烟草鉴定材料，其中4和5(B1和B2)为pBI121-atp6-EGFP转基因材料(1681 bp)；M2：DNA分子质量标准(DL2000)；8：质粒pBI121-atp6-EGFP(1182 bp)；9：WT；10：H2O；11～14(B1-B4)：烟草鉴定材料，其中11和12(B1和B2)为pBI121-atp6-EGFP转基因材料(1182 bp)；15：质粒pBI121-atp6-EGFP(1206 bp)；16：WT；17：H2O；18～21(B1-B4)：烟草鉴定材料，其中18和19(B1和B2)为pBI121-atp6-EGFP转基因材料(1206 bp)M1：DNA marker(AL 15000)；1：pBI 121-atp6-EGFP(1681 bp)；2：WT；3：H2O；4-7(B1-B4)：Identification of transgenic plant，4 and 5(B1 and B2)：transgenic plants of pBI121-atp6-EGFP(1681 bp)；M2：DNA marker(DL2000)；8：pBI121-atp6-EGFP(1182 bp)；9：WT；10：H2O；11-14(B1-B4)：Identification of transgenic plant，11 and 12(B1 and B2)：Transgenic plants of pBI121-atp6-EGFP(1182 bp)；15：pBI121-atp6-EGFP(1206 bp)；16：WT；17：H2O；18-21(B1-B4)：Identification of transgenic plant，18 and 19(B1 and B2)：Transgenic plants of pBI121-atp6-EGFP(1206 bp)图7 转基因烟草阳性植株的鉴定结果Fig.7 PCR identification of transgenic positive plants已有研究表明植物雄性不育与线粒体DNA的变异紧密相关[18-19]。基因重组产生嵌合基因或新的阅读框，出现新的蛋白基因表达产物或引起正常线粒体基因转录、RNA编辑和蛋白翻译异常，造成线粒体能量代谢或ATP复合体蛋白亚基异常，使线粒体发生功能紊乱，从而产生CMS[20]。atp6是植物线粒体呼吸链复合体V的亚基，作为呼吸链上重要组成部分，呼吸异常导致能量供应不足，而在小孢子发育过程中需要大量能量，能量供应不足导致花粉败育[21]。在玉米[8]、油菜[9]、水稻[11]、芥菜[12]和苎麻[22]等植物中均发现atp6基因导致植物CMS。前期对红麻花粉发育过程的研究表明，atp6在红麻花粉发育过程中发挥非常关键的作用[15]，暗示atp6CMS与红麻CMS密切相关。本研究发现，与红麻保持系UG93B序列比对，UG93A 的atp6基因CDS有24 bp缺失和3 bp插入，与红麻的CMS P3A相比，UG93A在atp6基因起始密码子的下游第59 bp处少6个碱基(GTTTTT)，推测该位点可能是红麻线粒体基因重组的活跃位点，进一步表明atp6基因与红麻CMS密切相关。关于atp6基因与红麻CMS的更深层次关系本课题组正在探究。3.2过表达载体的构建为红麻基因功能研究打下基础目前，红麻CMS的分子机理研究虽取得较大进展，但关于红麻CMS核质作用的分子机制仍未清楚，对红麻CMS相关atp6基因的研究不够透彻[23]。为了进一步验证和分析红麻UG93S的CMS相关基因atp6功能，本研究以红麻不育材料UG93A的cDNA为模板利用同源克隆技术克隆atp6基因序列，通过In-Fusion融合技术研究方法成功构建pBI121-atp6-EGFP植物过表达载体，并以农杆菌介导法转化烟草，获得2株转基因阳性烟草植株；利用3对引物组合对转基因阳性植株进行鉴定，其中两对引物是利用pBI121表达载体序列与目的基因序列组合的方式进行鉴定，可有效避免单一使用目的基因鉴定转基因植株易造成的假阳性现象，且操作省时简便。构建过表达载体是研究红麻atp6基因的关键步骤[24]，转基因烟草的成功获得为后续从分子蛋白表达、细胞定位及生物学形态等层面开展atp6基因与红麻CMS功能验证研究提供材料基础[25-26]。4结 论从红麻不育系UG93A中获得atp6基因CDS全长1182 bp，并以UG93A中atp6基因cDNA为模板成功构建pBI 121-atp6-EGFP过表达载体，转化野生型烟草后获得2株转基因阳性烟草植株。构建的红麻线粒体基因atp6过表达载体遗传转化体系，可用于指导后续atp6基因调控红麻CMS分子机理研究。参考文献：[1]史春霞，白 洋，郁崇文. 黄、红麻资源的优化与开发利用[J]. 中国麻作，2001，23(1)：41-44.[2]陶爱芬，张晓琛，祁建民. 红麻综合利用研究进展与产业化前景[J]. 中国麻业科学，2007，29(1)：1-5.[3]李德芳. 红/黄麻新用途综合开发与国际合作[J]. 中国麻业科学，2007，29(S2)：411-414.[4]周瑞阳. 红麻雄性不育株的发现[J]. 中国农业科学，2002，35(2)：213-213.[5]周瑞阳，张 新，张加强，等. 红麻细胞质雄性不育系的选育及杂种优势利用取得突破[J]. 中国农业科学，2008(1)：314.[6]刘恒蔚，周瑞阳，徐 俐. 光敏感雌性不育苎麻的光周期反应特性研究[J]. 作物学报，2003，29(2)：222-224.[7]Dewey R E，Timothy D H，Levings C R. Chimeric mitochondrial genes expressed in the male-sterile cytoplasm of maize[J]. Current Genetics，1992，20(6)：475-482.[8]Dewey R E，Timothy D H，Levings C S. A mitochondrial protein associated with cytoplasmic male sterility in the Tcytoplasm of maize[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1987，84：155374-155378.[9]Handa H，Gualberto J M，Grienenberger J M. Characterization of the mitochondrialorfBgene and its derivative，orf224，a chimeric open reading frame specific to one mitochondriagenome of the ‘Polima’ male-sterile cytoplasm in rapeseed(BrassicanapusL.)[J]. Current Genetics，1995，28(6)：546-552.[10]Wang H M，Ketela T，Keller W A，et al. Genetic correlation of theorf224/atp6gene region with Polima CMS inBrassicasomatichybrids[J]. Plant Molecular Biology,1995，27(4)：801-807.[11]Wang K，Gao F，Ji Y，et al. ORFH79 impair mitochondrial function via interaction with a subunit of electron transport chain complex III in Honglian cytoplasmic male sterile rice[J]. New Phytologist,2013，198(2)：408-418.[12]Jing B，Heng S，Tong D，et al. Malsterility-associated cytotoxic protein ORF288 inBrassicajunceacauses aborted pollen development[J]. Journal of Experimental Botany，2012，63(3)：1285-1295.[13]Landgren M，Zetterstrand M，Sundberg E，et al. Alloplasmic male-sterileBrassicalines containingB.tournefortiimitochondria express an ORF 3'' of theatp6gene and a 32 kDa protein[J]. Plant Molecular Biology,1996，32(5)：879-890.[14]Matsuhira H，Kagami H，Kurata M，et al. Unusual and typicafeatures of a novel restorer-of-fertility gene of sugar beet (BetavulgarisL.)[J]. Genetics，2012，192(4)：1347-1358.[15]李 刚. 红麻细胞质雄性不育系线粒体蛋白质组差异分析与不育相关基因的发掘[D]. 南京：广西大学，2009.[16] Zhao Y，Liao X，Zhou B，et al. Mutation in the coding sequence ofatp6are associated with male sterile cytoplasm in kenaf(HibiscuscannabinusL)[J]. Euphytica，2016，207：169-175.[17]廖小芳. 红麻UG93A和UG93B线粒体基因组差异分析及CMS相关基因的发掘[D]. 南宁：广西大学，2015.[18]凌杏元. 植物胞质雄性不育分子机理研究进展团[J]. 植物学通报，2000，17(4)：319-332.[19]王永飞，马三梅，张鲁刚，等. 植物细胞质雄性不育的分子机理研究进展[J]. 自然科学进展，2002，12(10)：1009-1014.[20]梅启明. 红莲型和野败型水稻胞质雄性不育系mtDNA的比较研究明[J]. 武汉植物科学，1990，8(1)：2529.[21]史公军. 不结球白菜胞质雄性不育系atp6基因cDNA片段的克隆及序列分析[A]. 中国园艺学会蔬菜专业委员会、中国农业科学院蔬菜花卉研究所. 蔬菜分子育种研讨会论文集[C]. 北京：中国园艺学会，2004.[22]段继强，杜光辉，李建永，等. 苎麻atp6和atp9基因的克隆表达及与细胞质雄性不育的相关性[J]. 遗传，2008，30(11)：1487-1498.[23]赵艳红. 红麻atp9、atp6、atpA基因克隆、功能分析与分子标签发掘[D]. 广西大学，2014.[24]Zhu Y,Wang Z，Jing Y J，et al. Ectopic over-expression of BhHsfl，a heat shock factor from the resurrection plant Boea grometrica，leads to increased thermotolerance and retarded growth in transgenic Arabidopsis and tobacco[J]. Plant Molecular Biology,2009，71：451-467.[25]丁林云，张 微，王晋成，等. 过量表达棉花GhSAP1提高转基因烟草的耐盐性[J]. 中国农业科学，2014，47(8)：1458-1470.[26]魏东阳. 蛋白质组学及其应用研究[J]. 现代商贸工业，2019，40(16)：79-81.

文章来源：煤炭转化 网址: http://mtzh.400nongye.com/lunwen/itemid-12086.shtml

上一篇： C/N比对好氧堆肥中NH ₃挥发损失和
下一篇： 矿业工程论文_薄-中厚煤层智能化综采保障技术与装备