碱性亮氨酸拉链(Basic leucine zipper，bZIP)蛋白是最大且功能最具多样性的转录因子家族之一，该家族存在于所有的真核细胞中，包括酵母、脊椎动物和植物。bZIP转录因子具有一个由40～60个氨基酸组成的保守结构域，其包含1个碱性DNA结合域，可通过一个固定的N-X7-R/K结构与特异DNA序列结合；还包含一个亮氨酸拉链二聚体结构域与碱性区紧密结合，每7个氨基酸的第7位有一个亮氨酸以及其它疏水性残基位第3位和第4位，亮氨酸拉链形成一个两亲性的α螺旋，可影响bZIP蛋白与DNA结合之前的二聚化(图1)[1]。bZIP基因在真核生物中分布较多，但在不同真核生物中bZIP转录因子的分布也存在差异。勒正伟等[2]报道称，在线虫中含有31个bZIP转录因子，果蝇有27个，人类有56个，酵母中有17个；而在植物中，目前鉴定的拟南芥(Arabidopsisthaliana)含有75个，玉米含有125个，大豆含有131个。 bZIP蛋白是植物中一类重要的转录因子，其参与了植物从生长发育到胁迫响应的各种过程，包括种子发育、病菌防御、光信号转导、调控维管发育等。近年来，研究[5]发现bZIP还参与多种生物学进程，如器官和组织分化[3]、非折叠蛋白反应[4]、激素和糖信号传导过程，特别是在非生物胁迫的抗逆反应中起重要作用，例如盐胁迫、干旱胁迫、低温胁迫等[6]。Preeti等[7]研究发现，在拟南芥中过表达TabZIP能增强转基因拟南芥耐盐碱、干旱和高温的能力；因此，我们认为该基因可以作为一个候选基因，用以改善小麦对温度和其他非生物胁迫的耐受能力，在胁迫条件下可提高作物产量。在胁迫和激素处理条件下，刘莉等[8]利用qRT-PCR技术对OsbZIP16进行表达分析，结果表明在非生物胁迫条件下OsbZIP16被强烈诱导；在碱性胁迫下，GsbZIP67过表达促进了植株的生长；此外，GsbZIP67过表达也改变了转基因苜蓿碱性胁迫下的生理指标，证明了GsbZIP67是植物耐受碱性胁迫的积极调节因子[9]。 紫花苜蓿(Medicagosativa)，是全球栽培面积最大的牧草[10]，因其具有产量高、蛋白质含量丰富、适口性好等优良特点，被誉为“牧草之王”[11]。然而环境中的非生物胁迫因素，如干旱、盐、低温等影响紫花苜蓿产量和品质，严重制约了其产业化发展。筛选和培育抗逆苜蓿新品种是解决这一问题的有效途径。发掘抗逆相关基因，研究其调控抗逆性的生物学功能和机制，对于更好的指导苜蓿抗逆育种具有重要意义。因此，为了了解紫花苜蓿中bZIP转录因子的特性，解析紫花苜蓿bZIP基因的生物学功能，从而阐述bZIP基因响应紫花苜蓿抗逆调控机制，本研究利用RACE技术，获得紫花苜蓿MsbZIP1基因，同时对MsbZIP1基因进行生物信息学分析，并对其组织表达特性以及在多种非生物逆境和激素处理下的表达模式进行研究，拟通过遗传转化，获得转基因阳性株系，以期为揭示MsbZIP1基因在紫花苜蓿抗逆性调控中的作用奠定基础。 图1 bZIP转录因子基本结构域组成Fig.1 bZIP transcription factor basic domain composition 1 试验材料与方法 1.1 试验材料 本试验所用材料为‘中苜1号’紫花苜蓿(Medicagosativa‘Zhongmu No.1’)种子，由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所提供。本研究中所用拟南芥均为哥伦比亚生态型(Columbia)。所有试验均在中国农业科学院北京畜牧兽医研究所牧草资源研究室进行。 1.2 试验方法 1.2.1基因克隆 研究根据实验室获得的一个紫花苜蓿耐盐转录组数据(数据未发表)，得到了一个受盐胁迫诱导的Unigene，按照Clontech公司SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit试剂盒步骤进行克隆。依据其序列信息，设计5’-RACE引物GSP1和3’-RACE引物GSP2，PCR扩增目的基因的3’和5’端序列见表1，PCR反应体系50 μL:5’-RACE/3’-RACE cDNA 2.5 μL,UPM(10×)5 μL,GSP1/GSP2(10 μM)1 μL,10×Advantage 2 PCR BufferdNTP Mix(10 nM)5 μL,dNTP Mix(10 nM) 1 μL,PCR-Grade Water 34.5 μL,50×Advantage 2 Polymerase Mix 1 μL。反应程序为：94℃30 s，72℃3 min，5个循环；94℃30 s，70℃30 s，72℃2 min，5个循环；94℃30 s，68℃30 s，72℃3 min，25个循环。经PMD18-T载体连接，阳性克隆送上海英潍捷基生物技术有限公司测序，将获得的3’和5’端序列进行拼接，获得全长cDNA序列。 1.2.2生物信息学分析 采用EXPASy的Prot Param tool在线程 序(http://web.expasy.org/cgi-bin/prot-param/protparam)预测蛋白的分子量和等电点。采用Scan Prosit和SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)程序对基因进行蛋白家族预测。采用NetPhos 2.0 Serve(http://www.cbs.dtu.dk/services/Net-Phos/)预测蛋白质磷酸化位点。利用MEGAX软件分析蛋白同源性并构建系统进化树。 1.2.3植物培养 选取健康饱满的‘中苜1号’紫花苜蓿种子100粒置于预先铺好湿润滤纸的培养皿中萌发，待种子露白后，转移至1/2MS[12]培养基中，在人工智能温室中培养。培养条件为：光照16 h，温度25℃，湿度75%，光强400 μmol·m-2·s-2；黑暗8 h，温度23℃，湿度70%。 1.2.4各逆境胁迫处理 待幼苗生长两周后进行各种处理。盐胁迫、干旱胁迫、激素处理时，将水培苗分别移入含有0.1 mM氯化钠(Sodium chloride，NaCl)，15%聚乙二醇(Polyethylene glycol，PEG)，0.1 mM脱落酸(Abscisic acid，ABA)和0.1 mM生长素(Auxin，IAA)营养液中；热处理时，将水培苗放到37℃恒温光照培养箱中；冷胁迫时，将水培苗放到4℃冰箱中，于处理的0,2,4,6,12和24 h这6个时间段取样，样品保存于液氮中备用。 1.2.5实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析 采用Eastep?Super Total RNA Extraction Kit试剂盒(Promega，美国)提取样品的RNA，利用反转录试剂盒FastKing Gdna Dispelling RT SuperMix(天根生物技术有限公司，北京)获得cDNA。用SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)试剂盒(天根生物技术有限公司，北京)采用两步法进行qRT-PCR分析。基因特异引物为F1/R1(表1)，反应体系20 μL：2×SuperReal PreMix Plus 10.0 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，上游引物(10 μmol·L-1)0.6 μL，下游引物(10 μmol·L-1)0.6 μL，cDNA 3 μL，ddH2O 5.4 μL。qRT-PCR反应程序为：95℃15 min，95℃10 s，60℃20 s，60℃20 s，40个循环。以拟南芥ACT和紫花苜蓿ACT基因为内参基因，基因引物为AtACTF2/R2和MsACTF3/R3(表1)。采用2-ΔΔCT法进行分析，并通过SPSS 18.0进行显著性分析(P<0.05)。每个处理3次生物学重复，每个生物学重复3次技术重复。 表1 所需引物序列Table 1 Primer sequences used in this study引物名称primer name序列(5’—3’) Sequence(5’—3’)用途 PurposeGSP1TGTTCGTCCTATCTTGTTCCCACCT3′RACEGSP2AAAGCGTGCAAGGGAGGAGATACA5′RACEMsbZIP1-F1ACTTCTTCTTCCACCGTTGATGTCqRT-PCRMsbZIP1-R1AAGTAGCCAGAGGTCCAAGTTCAGAtACT-F2CGCCATCCAAGCTGTTCTCqRT-PCRAtACT-R2TCACGTCCAGCAAGGTCAAGMsACT-F3CAAAAGATGGCAGATGCTGAGGATqRT-PCRMsACT-R3CATGACACCAGTATGACGAGGTCGMsbZIP1-F4TGACCATGGTAGATCTGATGGAAAGAGTGTTATCAATTGCORFMsbZIP1-R4ATTCGAGCTGGTCACCTCACTTGTCGTCTTCGGCMsbZIP1-F5GGTGGCTCCTACAAATGCCACAAGAAAATGGAPCRMsbZIP1-R5CAAGAAAATGGA AAGAGTGTTATC 1.2.6MsbZIP1超表达载体的构建 根据MsbZIP1 cDNA的全长序列，设计含有BstB1、BstEⅡ酶切位点的开放阅读框(Open reading frame，ORF)引物F4/R4(表1)，用该引物扩增MsbZIP1的ORF序列，得到带有酶切位点的MsbZIP1 ORF片段；用BstB1/BstEⅡ双酶切该目的基因片段和pCAMBIA3301质粒载体，利用EasyPure Quick Gel Extraction Kit，进行产物纯化回收，回收后的产物经T4DNA连接酶的作用连接。将产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，阳性克隆送上海英潍捷基生物技术有限公司进行测序鉴定。 1.3 农杆菌介导的遗传转化和后代筛选 拟南芥种子经70%乙醇处理2 min，5%次氯酸钠处理5 min，然后用灭菌水冲洗5遍播于MS培养基上。在培养箱中生长7天后，移到花盆中，放于温室中继续培养至盛花期。在200 μL农杆菌GV3101感受态细胞中加入测序正确的PCAMBIA3301-MsbZIP1质粒1 μg，吸打混匀后冰浴30 min；放入液氮中1 min，然后37℃5 min，加入1 000 μL无抗性的农杆菌YEB(Yeast Mannitol Medium，YEB)液体培养基，28℃150 rpm培养4～6 h；7 000 rpm离心3 min富集菌体，弃大部分上清，留下大约200 μL上清液，悬浮富集菌体；将菌液均匀涂于含有卡那霉素(50 μg·mL-1Kan)和利福平(25 μg·mL-1Rif)的YEB选择培养基上，恒温培养箱28℃倒置培养2天后挑取单菌落在含有50 μg·mL-1Kan和25 μg·mL-1Rif的YEB培养液中，28℃ 250 rpm振荡培养48 h；接着将菌液进行PCR扩增、鉴定，将测序正确的菌液采用蘸花法[13]侵染处于盛花期的拟南芥；待侵染后的拟南芥收种后，在含有50 mg·L-1草甘膦(Glyphosate，PPT)的1/2MS(含糖)培养基上筛选转基因抗性植株。在35s启动子和基因序列上分别设计上下游引物F5和R5(表1)，提取筛选出的抗性植株的DNA，用F5/R5进行PCR检测，检测为阳性的植株(T1代)继续繁殖。T1代株系自交后单株收种获得T1代种子。将T1代种子播种后每个株系选择10株进行单株种植、单株收种(T2代)，在抗性培养基上筛选，后代全部为抗性苗的即为T3代纯合体，收种备用。 2 结果与分析 2.1 紫花苜蓿MsbZIP1基因的克隆 利用RACE技术，分别在5’端和3’端获得了1 521 bp和1 839 bp的序列(图2)。利用DNAMAN 6.0软件对两端序列进行拼接后，获得了一段长度为1 986 bp的片段。经序列分析，该片段含有一个长度为1 176 bp的开放阅读框(ORF)。将序列进行BLAST分析，发现该ORF与其他物种中的bZIP基因高度同源，初步认为获得了目的基因。 图2MsbZIP1基因的5’末端片段(A)和3’末端片段(B)Fig.2 5’RACE (A) and 3’RACE (B) results ofMsbZIP1 gene注:M:Marker；1:5’末端片段；2:3’末端片段Note:M:Marker;1:5’RACE;2:3’RACE 为进一步确认该序列的身份，对序列进行了生物信息学分析。该序列ORF全长为1 176 bp，编码391个氨基酸。MsbZIP1蛋白分子量为 42.3 kD，理论等电点为 6.5，蛋白不稳定系数(Instability index)为57.28，是个不稳定蛋白，蛋白在C端有一个bZIP结构域，由第192位点的脯氨酸(Proline)到256位点的亮氨酸氨(Leucine)组成(图3)。Jakoby[14]根据bZIP转录因子碱性氨基酸区域的保守型，利用MEME软件，将拟南芥75个bZIP转录因子分为A～S共10个亚家族，本研究采用最大似然法，将拟南芥bZIP家族蛋白与该蛋白比对并进行系统进化树分析。结果表明，该蛋白和AtbZIP9,AtbZIP10,AtbZIP25,AtbZIP63的亲缘关系比较近，共同组成一个分支；AtbZIP9,10,25,63属于拟南芥C亚家族bZIP转录因子，因此把该蛋白归为C亚家族，将该基因命名为MsbZIP1(图4)。MsbZIP1蛋白主要含有 35个丝氨酸(Serine)、9个苏氨酸(Threonine)和2个酪氨酸(Tyrosine)磷酸化位点(图5)。 图3MsbZIP1蛋白的氨基酸序列Fig.3 Amino acid sequence inMsbZIP1注：图中阴影部分为碱性结构域(N-x7-R/K-x9)；下画线部分为亮氨酸拉链结构域(L-x6-L-x6-L)Note:The shaded parts are basic region (N-x7-R/K-x9)；Underlined parts are leucine zipper motif (L-x6-L-x6-L) 图4MsbZIP1蛋白与拟南芥bZIP转录因子蛋白家族的进化树分析Fig.4 Phylogenetic tree analysis ofMsbZIP1 andArabidopsisbZIP proteins family 图5MsbZIP1蛋白磷酸化位点预测Fig.5 Protein phosphorylation site prediction ofMsbZIP1 2.2MsbZIP1在紫花苜蓿不同组织中的表达 为了研究MsbZIP1的表达模式，从紫花苜蓿同一植株上分别取根部、茎部、叶片、花各部位进行组织特异性分析。定量结果显示，MsbZIP1在整株植物中均有表达，其中叶中表达量最高，花中表达量最低，叶片中的表达量是花的44倍(图6)。 图6MsbZIP1 基因在紫花苜蓿不同组织中的表达水平Fig.6 expression ofMsbZIP1 gene in different tissuesof alfalfa注：图中**代表与紫花苜蓿MsbZIP1基因在花中的表达量相比差异极显著(P<0.01)Note:** in the figure represents a significant difference compared with the expression ofMsbZIP1 gene in alfalfa(P<0.01) 2.3MsbZIP1转录因子对多种逆境胁迫的响应 为了初步预测MsbZIP1基因的功能，明确不同逆境胁迫对基因表达的影响，本试验利用qRT-PCR技术对紫花苜蓿MsbZIP1转录因子在多种逆境条件下的表达量进行检测(图7)。研究发现在0.1 mM NaCl胁迫处理下，MsbZIP1转录因子的表达明显受到诱导，胁迫2 h，表达量显著增加，为0 h(对照)的41倍；随着胁迫时间的延长，MsbZIP1的转录水平不断升高，胁迫处理12 h时达到峰值，表达量提高了140多倍；胁迫处理 24 h后表达水平逐渐回落，整个诱导过程中MsbZIP1均表现为上调表达且上调水平显著，说明MsbZIP1参与紫花苜蓿盐胁迫的响应。 高温处理下，MsbZIP1的表达量在处理2 h时就迅速上调，并一直维持上升的趋势，到6 h时达到峰值，然后表达量下降到对照(0 h)的水平。PEG模拟的干旱胁迫条件下，MsbZIP1 RNA的转录水平在不同时间有小幅度的变化，但是没有达到显著水平；整体来看，基因表达对干旱胁迫的响应不明显。低温胁迫(4℃)诱导MsbZIP1基因表达量下调，并且在整个处理过程中，表达水平一直显著低于对照，表明低温对于MsbZIP1基因表达是负调控的。有研究[15]显示，激素影响bZIP转录因子的表达。本研究分析了2种外源激素ABA和IAA对基因的作用，研究结果显示，ABA显著上调MsbZIP1基因表达，在处理6 h后，表达水平一直维持显著高于对照(0 h)的水平，且呈持续上升的趋势。生长素同样促进MsZIP1 RNA转录水平，0.1 mM IAA处理12 h后，转录水平达到对照(0 h)的15.77倍。 以上结果表明MsbZIP1不仅受多种逆境胁迫，还受ABA和IAA等激素的正调控，可推测紫花苜蓿MsbZIP1转录因子可能参与了对多种逆境胁迫的响应过程。 2.4MsbZIP1对拟南芥的遗传转化 本研究从紫花苜蓿中克隆得到MsbZIP1基因的完整开放阅读框(ORF)，将其连入植物双元表达载体pCAMBIA3301，通过PCR检测，获得了与预期大小相符的扩增片段(图8A)。对初步检测为阳性的质粒进行测序验证，测序结果显示插入的片段完整，没有缺失、突变、移码等现象发生，表明pCAMBIA3301-MsbZIP1植物双元表达载体已经构建成功，然后通过农杆菌介导的花序浸染法对拟南芥进行遗传转化，转化后获得转基因T0代株系，再经扩繁、筛选，同时结合PCR验证，得到7株阳性苗(图8B)。随后采用qRT-PCR技术对部分转基因株系中目的基因的表达量进行检测，结果表明，MsbZIP1在所有的转基因株系中均有表达，表达水平在株系间存在差异，其中株系2，4和7的表达量相对较高，命名为OE2,OE4,OE7(如图8C)。 图7MsbZIP1基因在胁迫诱导后的相对表达量Fig. 7 The relative expression ofMsbZIP1gene under stresses注：图中**表示与0 h(对照)相比差异显著(P<0.01)Note:** in the figure indicates that the difference is significant compared with 0 h (the control) (P<0.01) 3 讨论 bZIP蛋白存在于所有的真核生物中，在过去的20年中，关于bZIP转录因子的研究已取得很大进展，其功能已在多种植物，如拟南芥、水稻(Oryzasativa)和大豆(Glycinemax)[16]等植物中进行了研究。bZIP转录因子参与植物发育和各种代谢过程以及各种生物或非生物胁迫应答过程；然而紫花苜蓿中bZIP的研究报道相对较少，对C类bZIP转录因子的研究目前还未见报道。本研究通过RACE方法从紫花苜蓿中克隆了一个bZIP基因，并对该基因进行序列分析和表达特性分析，发现该基因受多种逆境胁迫诱导。后期通过遗传转化获得了转基因拟南芥材料，为研究紫花苜蓿C类bZIP基因调控抗逆性的机制奠定了理论和材料基础。 图8 转基因拟南芥株系的PCR检测Fig.8 PCR identification of transgenicArabidopsislines注：A图表示双元表达载体pCAMBIA3301-MsbZIP1 PCR检测；B图表示转基因拟南芥PCR检测；C图表示MsbZIP1在转基因拟南芥中的表达量Note:Panel A shows the binary expression vector pCAMBIA3301-MsbZIP1 PCR detection;Panel B shows PCR detection of transgenicArabidopsisthaliana;Panel C shows the expression ofMsbZIP1 in transgenicArabidopsis bZIP转录因子碱性氨基酸区域高度保守，以此为基础，Jakoby[14]将拟南芥75个bZIP转录因子分为A～S共10个亚家族，而与抗逆相关的bZIP转录因子主要分布于A,B,C,S家族。C亚族的显著特点是具有蛋白质修饰的潜在磷酸化作用靶位点，而MsbZIP1蛋白磷酸化位点预测结果表明，该蛋白主要含有 35个丝氨酸(Serine)、9个苏氨酸(Threonine)和2个酪氨酸(Tyrosine)磷酸化位点，符合C亚族的特征。拟南芥C亚族的转录因子主要包含AtbZIP9,AtbZIP10,AtbZIP25,AtbZIP63这4个成员，MsbZIP1和拟南芥C亚家族基因序列相近。系统进化树分析表明，MsbZIP1蛋白和AtbZIP9,10,25,63共同组成一个分支(图4)，说明MsbZIP1基因是一个C亚类bZIP转录因子，可能具有和拟南芥C亚族基因相类似的功能。将大豆的基因GmbZIP44、bZIP62和bZIP78这3个基因转入到拟南芥中，可以提高拟南芥对盐和冷冻胁迫的耐受性[17]，bZIP基因除了在植物抗逆性方面发挥了重要的作用外，有研究表明欧芹(Petroselinumcrispum)中CPFR2和G/HBF-1可能还与对环境和病害侵袭的防卫反应有关[18]。C亚族也可以在ABA和葡萄糖信号中起调控作用[19-20]。MsbZIP1基因是否具有以上的一种或者多种功能，需要在今后的研究中做进一步的验证。 在植物的生长发育中，盐胁迫是较为常见的，也是抑制植物生长发育最主要的因素。越来越多的研究[21]表明，bZIP参与多盐逆境胁迫的调控。转入刚毛怪柳(Tamarixhispida)ThbZIP1基因的烟草，其耐盐能力与野生型相比大大提高[22]，本研究中发现在NaCl胁迫处理下，MsbZIP1转录因子的表达明显受到诱导，胁迫2 h时表达量显著增加；随着胁迫时间的延长，MsbZIP1的转录水平也不断升高，整个诱导过程中MsbZIP1均表现为上调表达且上调水平显著，说明MsbZIP1参与对紫花苜蓿盐胁迫的响应。 当植物所处的环境温度高于其最适生长温度时，就会对植物的生长发育产生不良影响，这就是热胁迫。研究表明[21]，bZIP转录因子在植物热胁迫的途径中扮演着不可或缺的角色。Wang等[23]研究表明玉米(Zeamays)bZIP转录因子ZmbZIP4表达受高温诱导。本研究中，高温处理下，MsbZIP1的表达在处理2 h就迅速上调，并一直呈持续上升的趋势，到6 h达到峰值，然后表达量下降到对照水平，说明高温可以诱导紫花苜蓿中MsbZIP1基因的表达，这与已有的研究结果[23]一致。在水稻中，OsbZIP52/RISBZ5转录因子被证实是负调控因子，主要参与到水稻的低温(4℃)胁迫，使其对干旱和低温更加敏感[24]；在本研究中，低温胁迫(4℃)诱导MsbZIP1基因表达下调，并且在整个处理过程中，表达水平一直显著低于对照，表明低温对于MsbZIP1基因表达是负调控的。 由于bZIP参与了多种植物激素胁迫的应激调控，以此来提高植物的抗逆性[25]，所以，本研究分析了MsbZIP1基因在ABA和IAA 2种激素下的表达情况。qRT-PCR分析结果表明，ABA显著上调MsbZIP1基因表达。多项研究显示[26]，bZIP参与调控某些与ABA途径相关的信号传导通路。在拟南芥种子萌发及开花期间，bZIP 转录因子ABI5(ABA insensitive 5) 和ABFs(ABRE binding factors)是调控ABA信号的关键因子[27]。植物中的ABF2/AREB1、ABF4/AREB2和ABF3均参与ABA信号的应答调控[28]，因此，可推测紫花苜蓿中的MsbZIP1基因可能也参与了ABA途径相关的过程。在对A亚族的ZmbZIP4研究时发现，该基因通过调控IAA合成，进而影响根的生长，过表达ZmbZIP4能显著促进根的生长发育[29]，本研究用IAA处理紫花苜蓿后，MsbZIP1 RNA转录水平被显著上调，在处理12 h后，转录水平达到对照15.77倍，因此，推测紫花苜蓿中的MsbZIP1基因可能也参与了植物的某些生长发育过程，具体还需要进一步的研究论证。 4结论 从紫花苜蓿中克隆得到MsbZIP1基因的cDNA全长为1 176bp，MsbZIP1属于bZIP家族C亚族；MsbZIP1在紫花苜蓿叶中表达量最高，根次之，花中表达量最低；MsbZIP1对干旱、高盐、高温、低温，以及ABA和IAA处理都有不同程度的响应，推测该基因可能参与调控紫花苜蓿多种非生物胁迫过程。本试验通过构建表达载体PCAMBIA3301-MsbZIP1，采用农杆菌介导的花序浸染法转化拟南芥，得到超表达的转基因拟南芥，为进一步研究MsbZIP1基因的生物学功能奠定了基础。 [1] Nijhawan A,Jain M,Tyagi A K,etal. 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Plant Physiology,2018,178:753-770 碱性亮氨酸拉链(Basic leucine zipper，bZIP)蛋白是最大且功能最具多样性的转录因子家族之一，该家族存在于所有的真核细胞中，包括酵母、脊椎动物和植物。bZIP转录因子具有一个由40～60个氨基酸组成的保守结构域，其包含1个碱性DNA结合域，可通过一个固定的N-X7-R/K结构与特异DNA序列结合；还包含一个亮氨酸拉链二聚体结构域与碱性区紧密结合，每7个氨基酸的第7位有一个亮氨酸以及其它疏水性残基位第3位和第4位，亮氨酸拉链形成一个两亲性的α螺旋，可影响bZIP蛋白与DNA结合之前的二聚化(图1)[1]。bZIP基因在真核生物中分布较多，但在不同真核生物中bZIP转录因子的分布也存在差异。勒正伟等[2]报道称，在线虫中含有31个bZIP转录因子，果蝇有27个，人类有56个，酵母中有17个；而在植物中，目前鉴定的拟南芥(Arabidopsisthaliana)含有75个，玉米含有125个，大豆含有131个。bZIP蛋白是植物中一类重要的转录因子，其参与了植物从生长发育到胁迫响应的各种过程，包括种子发育、病菌防御、光信号转导、调控维管发育等。近年来，研究[5]发现bZIP还参与多种生物学进程，如器官和组织分化[3]、非折叠蛋白反应[4]、激素和糖信号传导过程，特别是在非生物胁迫的抗逆反应中起重要作用，例如盐胁迫、干旱胁迫、低温胁迫等[6]。Preeti等[7]研究发现，在拟南芥中过表达TabZIP能增强转基因拟南芥耐盐碱、干旱和高温的能力；因此，我们认为该基因可以作为一个候选基因，用以改善小麦对温度和其他非生物胁迫的耐受能力，在胁迫条件下可提高作物产量。在胁迫和激素处理条件下，刘莉等[8]利用qRT-PCR技术对OsbZIP16进行表达分析，结果表明在非生物胁迫条件下OsbZIP16被强烈诱导；在碱性胁迫下，GsbZIP67过表达促进了植株的生长；此外，GsbZIP67过表达也改变了转基因苜蓿碱性胁迫下的生理指标，证明了GsbZIP67是植物耐受碱性胁迫的积极调节因子[9]。紫花苜蓿(Medicagosativa)，是全球栽培面积最大的牧草[10]，因其具有产量高、蛋白质含量丰富、适口性好等优良特点，被誉为“牧草之王”[11]。然而环境中的非生物胁迫因素，如干旱、盐、低温等影响紫花苜蓿产量和品质，严重制约了其产业化发展。筛选和培育抗逆苜蓿新品种是解决这一问题的有效途径。发掘抗逆相关基因，研究其调控抗逆性的生物学功能和机制，对于更好的指导苜蓿抗逆育种具有重要意义。因此，为了了解紫花苜蓿中bZIP转录因子的特性，解析紫花苜蓿bZIP基因的生物学功能，从而阐述bZIP基因响应紫花苜蓿抗逆调控机制，本研究利用RACE技术，获得紫花苜蓿MsbZIP1基因，同时对MsbZIP1基因进行生物信息学分析，并对其组织表达特性以及在多种非生物逆境和激素处理下的表达模式进行研究，拟通过遗传转化，获得转基因阳性株系，以期为揭示MsbZIP1基因在紫花苜蓿抗逆性调控中的作用奠定基础。图1 bZIP转录因子基本结构域组成Fig.1 bZIP transcription factor basic domain composition1 试验材料与方法1.1 试验材料本试验所用材料为‘中苜1号’紫花苜蓿(Medicagosativa‘Zhongmu No.1’)种子，由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所提供。本研究中所用拟南芥均为哥伦比亚生态型(Columbia)。所有试验均在中国农业科学院北京畜牧兽医研究所牧草资源研究室进行。1.2 试验方法1.2.1基因克隆 研究根据实验室获得的一个紫花苜蓿耐盐转录组数据(数据未发表)，得到了一个受盐胁迫诱导的Unigene，按照Clontech公司SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit试剂盒步骤进行克隆。依据其序列信息，设计5’-RACE引物GSP1和3’-RACE引物GSP2，PCR扩增目的基因的3’和5’端序列见表1，PCR反应体系50 μL:5’-RACE/3’-RACE cDNA 2.5 μL,UPM(10×)5 μL,GSP1/GSP2(10 μM)1 μL,10×Advantage 2 PCR BufferdNTP Mix(10 nM)5 μL,dNTP Mix(10 nM) 1 μL,PCR-Grade Water 34.5 μL,50×Advantage 2 Polymerase Mix 1 μL。反应程序为：94℃30 s，72℃3 min，5个循环；94℃30 s，70℃30 s，72℃2 min，5个循环；94℃30 s，68℃30 s，72℃3 min，25个循环。经PMD18-T载体连接，阳性克隆送上海英潍捷基生物技术有限公司测序，将获得的3’和5’端序列进行拼接，获得全长cDNA序列。1.2.2生物信息学分析 采用EXPASy的Prot Param tool在线程 序(http://web.expasy.org/cgi-bin/prot-param/protparam)预测蛋白的分子量和等电点。采用Scan Prosit和SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)程序对基因进行蛋白家族预测。采用NetPhos 2.0 Serve(http://www.cbs.dtu.dk/services/Net-Phos/)预测蛋白质磷酸化位点。利用MEGAX软件分析蛋白同源性并构建系统进化树。1.2.3植物培养 选取健康饱满的‘中苜1号’紫花苜蓿种子100粒置于预先铺好湿润滤纸的培养皿中萌发，待种子露白后，转移至1/2MS[12]培养基中，在人工智能温室中培养。培养条件为：光照16 h，温度25℃，湿度75%，光强400 μmol·m-2·s-2；黑暗8 h，温度23℃，湿度70%。1.2.4各逆境胁迫处理 待幼苗生长两周后进行各种处理。盐胁迫、干旱胁迫、激素处理时，将水培苗分别移入含有0.1 mM氯化钠(Sodium chloride，NaCl)，15%聚乙二醇(Polyethylene glycol，PEG)，0.1 mM脱落酸(Abscisic acid，ABA)和0.1 mM生长素(Auxin，IAA)营养液中；热处理时，将水培苗放到37℃恒温光照培养箱中；冷胁迫时，将水培苗放到4℃冰箱中，于处理的0,2,4,6,12和24 h这6个时间段取样，样品保存于液氮中备用。1.2.5实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析 采用Eastep?Super Total RNA Extraction Kit试剂盒(Promega，美国)提取样品的RNA，利用反转录试剂盒FastKing Gdna Dispelling RT SuperMix(天根生物技术有限公司，北京)获得cDNA。用SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)试剂盒(天根生物技术有限公司，北京)采用两步法进行qRT-PCR分析。基因特异引物为F1/R1(表1)，反应体系20 μL：2×SuperReal PreMix Plus 10.0 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，上游引物(10 μmol·L-1)0.6 μL，下游引物(10 μmol·L-1)0.6 μL，cDNA 3 μL，ddH2O 5.4 μL。qRT-PCR反应程序为：95℃15 min，95℃10 s，60℃20 s，60℃20 s，40个循环。以拟南芥ACT和紫花苜蓿ACT基因为内参基因，基因引物为AtACTF2/R2和MsACTF3/R3(表1)。采用2-ΔΔCT法进行分析，并通过SPSS 18.0进行显著性分析(P<0.05)。每个处理3次生物学重复，每个生物学重复3次技术重复。表1 所需引物序列Table 1 Primer sequences used in this study引物名称primer name序列(5’—3’) Sequence(5’—3’)用途 PurposeGSP1TGTTCGTCCTATCTTGTTCCCACCT3′RACEGSP2AAAGCGTGCAAGGGAGGAGATACA5′RACEMsbZIP1-F1ACTTCTTCTTCCACCGTTGATGTCqRT-PCRMsbZIP1-R1AAGTAGCCAGAGGTCCAAGTTCAGAtACT-F2CGCCATCCAAGCTGTTCTCqRT-PCRAtACT-R2TCACGTCCAGCAAGGTCAAGMsACT-F3CAAAAGATGGCAGATGCTGAGGATqRT-PCRMsACT-R3CATGACACCAGTATGACGAGGTCGMsbZIP1-F4TGACCATGGTAGATCTGATGGAAAGAGTGTTATCAATTGCORFMsbZIP1-R4ATTCGAGCTGGTCACCTCACTTGTCGTCTTCGGCMsbZIP1-F5GGTGGCTCCTACAAATGCCACAAGAAAATGGAPCRMsbZIP1-R5CAAGAAAATGGA AAGAGTGTTATC1.2.6MsbZIP1超表达载体的构建 根据MsbZIP1 cDNA的全长序列，设计含有BstB1、BstEⅡ酶切位点的开放阅读框(Open reading frame，ORF)引物F4/R4(表1)，用该引物扩增MsbZIP1的ORF序列，得到带有酶切位点的MsbZIP1 ORF片段；用BstB1/BstEⅡ双酶切该目的基因片段和pCAMBIA3301质粒载体，利用EasyPure Quick Gel Extraction Kit，进行产物纯化回收，回收后的产物经T4DNA连接酶的作用连接。将产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，阳性克隆送上海英潍捷基生物技术有限公司进行测序鉴定。1.3 农杆菌介导的遗传转化和后代筛选拟南芥种子经70%乙醇处理2 min，5%次氯酸钠处理5 min，然后用灭菌水冲洗5遍播于MS培养基上。在培养箱中生长7天后，移到花盆中，放于温室中继续培养至盛花期。在200 μL农杆菌GV3101感受态细胞中加入测序正确的PCAMBIA3301-MsbZIP1质粒1 μg，吸打混匀后冰浴30 min；放入液氮中1 min，然后37℃5 min，加入1 000 μL无抗性的农杆菌YEB(Yeast Mannitol Medium，YEB)液体培养基，28℃150 rpm培养4～6 h；7 000 rpm离心3 min富集菌体，弃大部分上清，留下大约200 μL上清液，悬浮富集菌体；将菌液均匀涂于含有卡那霉素(50 μg·mL-1Kan)和利福平(25 μg·mL-1Rif)的YEB选择培养基上，恒温培养箱28℃倒置培养2天后挑取单菌落在含有50 μg·mL-1Kan和25 μg·mL-1Rif的YEB培养液中，28℃ 250 rpm振荡培养48 h；接着将菌液进行PCR扩增、鉴定，将测序正确的菌液采用蘸花法[13]侵染处于盛花期的拟南芥；待侵染后的拟南芥收种后，在含有50 mg·L-1草甘膦(Glyphosate，PPT)的1/2MS(含糖)培养基上筛选转基因抗性植株。在35s启动子和基因序列上分别设计上下游引物F5和R5(表1)，提取筛选出的抗性植株的DNA，用F5/R5进行PCR检测，检测为阳性的植株(T1代)继续繁殖。T1代株系自交后单株收种获得T1代种子。将T1代种子播种后每个株系选择10株进行单株种植、单株收种(T2代)，在抗性培养基上筛选，后代全部为抗性苗的即为T3代纯合体，收种备用。2 结果与分析2.1 紫花苜蓿MsbZIP1基因的克隆利用RACE技术，分别在5’端和3’端获得了1 521 bp和1 839 bp的序列(图2)。利用DNAMAN 6.0软件对两端序列进行拼接后，获得了一段长度为1 986 bp的片段。经序列分析，该片段含有一个长度为1 176 bp的开放阅读框(ORF)。将序列进行BLAST分析，发现该ORF与其他物种中的bZIP基因高度同源，初步认为获得了目的基因。图2MsbZIP1基因的5’末端片段(A)和3’末端片段(B)Fig.2 5’RACE (A) and 3’RACE (B) results ofMsbZIP1 gene注:M:Marker；1:5’末端片段；2:3’末端片段Note:M:Marker;1:5’RACE;2:3’RACE为进一步确认该序列的身份，对序列进行了生物信息学分析。该序列ORF全长为1 176 bp，编码391个氨基酸。MsbZIP1蛋白分子量为 42.3 kD，理论等电点为 6.5，蛋白不稳定系数(Instability index)为57.28，是个不稳定蛋白，蛋白在C端有一个bZIP结构域，由第192位点的脯氨酸(Proline)到256位点的亮氨酸氨(Leucine)组成(图3)。Jakoby[14]根据bZIP转录因子碱性氨基酸区域的保守型，利用MEME软件，将拟南芥75个bZIP转录因子分为A～S共10个亚家族，本研究采用最大似然法，将拟南芥bZIP家族蛋白与该蛋白比对并进行系统进化树分析。结果表明，该蛋白和AtbZIP9,AtbZIP10,AtbZIP25,AtbZIP63的亲缘关系比较近，共同组成一个分支；AtbZIP9,10,25,63属于拟南芥C亚家族bZIP转录因子，因此把该蛋白归为C亚家族，将该基因命名为MsbZIP1(图4)。MsbZIP1蛋白主要含有 35个丝氨酸(Serine)、9个苏氨酸(Threonine)和2个酪氨酸(Tyrosine)磷酸化位点(图5)。图3MsbZIP1蛋白的氨基酸序列Fig.3 Amino acid sequence inMsbZIP1注：图中阴影部分为碱性结构域(N-x7-R/K-x9)；下画线部分为亮氨酸拉链结构域(L-x6-L-x6-L)Note:The shaded parts are basic region (N-x7-R/K-x9)；Underlined parts are leucine zipper motif (L-x6-L-x6-L)图4MsbZIP1蛋白与拟南芥bZIP转录因子蛋白家族的进化树分析Fig.4 Phylogenetic tree analysis ofMsbZIP1 andArabidopsisbZIP proteins family图5MsbZIP1蛋白磷酸化位点预测Fig.5 Protein phosphorylation site prediction ofMsbZIP12.2MsbZIP1在紫花苜蓿不同组织中的表达为了研究MsbZIP1的表达模式，从紫花苜蓿同一植株上分别取根部、茎部、叶片、花各部位进行组织特异性分析。定量结果显示，MsbZIP1在整株植物中均有表达，其中叶中表达量最高，花中表达量最低，叶片中的表达量是花的44倍(图6)。图6MsbZIP1 基因在紫花苜蓿不同组织中的表达水平Fig.6 expression ofMsbZIP1 gene in different tissuesof alfalfa注：图中**代表与紫花苜蓿MsbZIP1基因在花中的表达量相比差异极显著(P<0.01)Note:** in the figure represents a significant difference compared with the expression ofMsbZIP1 gene in alfalfa(P<0.01)2.3MsbZIP1转录因子对多种逆境胁迫的响应为了初步预测MsbZIP1基因的功能，明确不同逆境胁迫对基因表达的影响，本试验利用qRT-PCR技术对紫花苜蓿MsbZIP1转录因子在多种逆境条件下的表达量进行检测(图7)。研究发现在0.1 mM NaCl胁迫处理下，MsbZIP1转录因子的表达明显受到诱导，胁迫2 h，表达量显著增加，为0 h(对照)的41倍；随着胁迫时间的延长，MsbZIP1的转录水平不断升高，胁迫处理12 h时达到峰值，表达量提高了140多倍；胁迫处理 24 h后表达水平逐渐回落，整个诱导过程中MsbZIP1均表现为上调表达且上调水平显著，说明MsbZIP1参与紫花苜蓿盐胁迫的响应。高温处理下，MsbZIP1的表达量在处理2 h时就迅速上调，并一直维持上升的趋势，到6 h时达到峰值，然后表达量下降到对照(0 h)的水平。PEG模拟的干旱胁迫条件下，MsbZIP1 RNA的转录水平在不同时间有小幅度的变化，但是没有达到显著水平；整体来看，基因表达对干旱胁迫的响应不明显。低温胁迫(4℃)诱导MsbZIP1基因表达量下调，并且在整个处理过程中，表达水平一直显著低于对照，表明低温对于MsbZIP1基因表达是负调控的。有研究[15]显示，激素影响bZIP转录因子的表达。本研究分析了2种外源激素ABA和IAA对基因的作用，研究结果显示，ABA显著上调MsbZIP1基因表达，在处理6 h后，表达水平一直维持显著高于对照(0 h)的水平，且呈持续上升的趋势。生长素同样促进MsZIP1 RNA转录水平，0.1 mM IAA处理12 h后，转录水平达到对照(0 h)的15.77倍。以上结果表明MsbZIP1不仅受多种逆境胁迫，还受ABA和IAA等激素的正调控，可推测紫花苜蓿MsbZIP1转录因子可能参与了对多种逆境胁迫的响应过程。2.4MsbZIP1对拟南芥的遗传转化本研究从紫花苜蓿中克隆得到MsbZIP1基因的完整开放阅读框(ORF)，将其连入植物双元表达载体pCAMBIA3301，通过PCR检测，获得了与预期大小相符的扩增片段(图8A)。对初步检测为阳性的质粒进行测序验证，测序结果显示插入的片段完整，没有缺失、突变、移码等现象发生，表明pCAMBIA3301-MsbZIP1植物双元表达载体已经构建成功，然后通过农杆菌介导的花序浸染法对拟南芥进行遗传转化，转化后获得转基因T0代株系，再经扩繁、筛选，同时结合PCR验证，得到7株阳性苗(图8B)。随后采用qRT-PCR技术对部分转基因株系中目的基因的表达量进行检测，结果表明，MsbZIP1在所有的转基因株系中均有表达，表达水平在株系间存在差异，其中株系2，4和7的表达量相对较高，命名为OE2,OE4,OE7(如图8C)。图7MsbZIP1基因在胁迫诱导后的相对表达量Fig. 7 The relative expression ofMsbZIP1gene under stresses注：图中**表示与0 h(对照)相比差异显著(P<0.01)Note:** in the figure indicates that the difference is significant compared with 0 h (the control) (P<0.01)3 讨论bZIP蛋白存在于所有的真核生物中，在过去的20年中，关于bZIP转录因子的研究已取得很大进展，其功能已在多种植物，如拟南芥、水稻(Oryzasativa)和大豆(Glycinemax)[16]等植物中进行了研究。bZIP转录因子参与植物发育和各种代谢过程以及各种生物或非生物胁迫应答过程；然而紫花苜蓿中bZIP的研究报道相对较少，对C类bZIP转录因子的研究目前还未见报道。本研究通过RACE方法从紫花苜蓿中克隆了一个bZIP基因，并对该基因进行序列分析和表达特性分析，发现该基因受多种逆境胁迫诱导。后期通过遗传转化获得了转基因拟南芥材料，为研究紫花苜蓿C类bZIP基因调控抗逆性的机制奠定了理论和材料基础。图8 转基因拟南芥株系的PCR检测Fig.8 PCR identification of transgenicArabidopsislines注：A图表示双元表达载体pCAMBIA3301-MsbZIP1 PCR检测；B图表示转基因拟南芥PCR检测；C图表示MsbZIP1在转基因拟南芥中的表达量Note:Panel A shows the binary expression vector pCAMBIA3301-MsbZIP1 PCR detection;Panel B shows PCR detection of transgenicArabidopsisthaliana;Panel C shows the expression ofMsbZIP1 in transgenicArabidopsisbZIP转录因子碱性氨基酸区域高度保守，以此为基础，Jakoby[14]将拟南芥75个bZIP转录因子分为A～S共10个亚家族，而与抗逆相关的bZIP转录因子主要分布于A,B,C,S家族。C亚族的显著特点是具有蛋白质修饰的潜在磷酸化作用靶位点，而MsbZIP1蛋白磷酸化位点预测结果表明，该蛋白主要含有 35个丝氨酸(Serine)、9个苏氨酸(Threonine)和2个酪氨酸(Tyrosine)磷酸化位点，符合C亚族的特征。拟南芥C亚族的转录因子主要包含AtbZIP9,AtbZIP10,AtbZIP25,AtbZIP63这4个成员，MsbZIP1和拟南芥C亚家族基因序列相近。系统进化树分析表明，MsbZIP1蛋白和AtbZIP9,10,25,63共同组成一个分支(图4)，说明MsbZIP1基因是一个C亚类bZIP转录因子，可能具有和拟南芥C亚族基因相类似的功能。将大豆的基因GmbZIP44、bZIP62和bZIP78这3个基因转入到拟南芥中，可以提高拟南芥对盐和冷冻胁迫的耐受性[17]，bZIP基因除了在植物抗逆性方面发挥了重要的作用外，有研究表明欧芹(Petroselinumcrispum)中CPFR2和G/HBF-1可能还与对环境和病害侵袭的防卫反应有关[18]。C亚族也可以在ABA和葡萄糖信号中起调控作用[19-20]。MsbZIP1基因是否具有以上的一种或者多种功能，需要在今后的研究中做进一步的验证。在植物的生长发育中，盐胁迫是较为常见的，也是抑制植物生长发育最主要的因素。越来越多的研究[21]表明，bZIP参与多盐逆境胁迫的调控。转入刚毛怪柳(Tamarixhispida)ThbZIP1基因的烟草，其耐盐能力与野生型相比大大提高[22]，本研究中发现在NaCl胁迫处理下，MsbZIP1转录因子的表达明显受到诱导，胁迫2 h时表达量显著增加；随着胁迫时间的延长，MsbZIP1的转录水平也不断升高，整个诱导过程中MsbZIP1均表现为上调表达且上调水平显著，说明MsbZIP1参与对紫花苜蓿盐胁迫的响应。当植物所处的环境温度高于其最适生长温度时，就会对植物的生长发育产生不良影响，这就是热胁迫。研究表明[21]，bZIP转录因子在植物热胁迫的途径中扮演着不可或缺的角色。Wang等[23]研究表明玉米(Zeamays)bZIP转录因子ZmbZIP4表达受高温诱导。本研究中，高温处理下，MsbZIP1的表达在处理2 h就迅速上调，并一直呈持续上升的趋势，到6 h达到峰值，然后表达量下降到对照水平，说明高温可以诱导紫花苜蓿中MsbZIP1基因的表达，这与已有的研究结果[23]一致。在水稻中，OsbZIP52/RISBZ5转录因子被证实是负调控因子，主要参与到水稻的低温(4℃)胁迫，使其对干旱和低温更加敏感[24]；在本研究中，低温胁迫(4℃)诱导MsbZIP1基因表达下调，并且在整个处理过程中，表达水平一直显著低于对照，表明低温对于MsbZIP1基因表达是负调控的。由于bZIP参与了多种植物激素胁迫的应激调控，以此来提高植物的抗逆性[25]，所以，本研究分析了MsbZIP1基因在ABA和IAA 2种激素下的表达情况。qRT-PCR分析结果表明，ABA显著上调MsbZIP1基因表达。多项研究显示[26]，bZIP参与调控某些与ABA途径相关的信号传导通路。在拟南芥种子萌发及开花期间，bZIP 转录因子ABI5(ABA insensitive 5) 和ABFs(ABRE binding factors)是调控ABA信号的关键因子[27]。植物中的ABF2/AREB1、ABF4/AREB2和ABF3均参与ABA信号的应答调控[28]，因此，可推测紫花苜蓿中的MsbZIP1基因可能也参与了ABA途径相关的过程。在对A亚族的ZmbZIP4研究时发现，该基因通过调控IAA合成，进而影响根的生长，过表达ZmbZIP4能显著促进根的生长发育[29]，本研究用IAA处理紫花苜蓿后，MsbZIP1 RNA转录水平被显著上调，在处理12 h后，转录水平达到对照15.77倍，因此，推测紫花苜蓿中的MsbZIP1基因可能也参与了植物的某些生长发育过程，具体还需要进一步的研究论证。4结论从紫花苜蓿中克隆得到MsbZIP1基因的cDNA全长为1 176bp，MsbZIP1属于bZIP家族C亚族；MsbZIP1在紫花苜蓿叶中表达量最高，根次之，花中表达量最低；MsbZIP1对干旱、高盐、高温、低温，以及ABA和IAA处理都有不同程度的响应，推测该基因可能参与调控紫花苜蓿多种非生物胁迫过程。本试验通过构建表达载体PCAMBIA3301-MsbZIP1，采用农杆菌介导的花序浸染法转化拟南芥，得到超表达的转基因拟南芥，为进一步研究MsbZIP1基因的生物学功能奠定了基础。参考文献[1] Nijhawan A,Jain M,Tyagi A K,etal. 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